Thuispagina » Artikelen » Bio-ethiek » Biologische en ethische aspecten aan de humane gentherapie » De biologische achtergrond van de humane somatische- en kiembaangentherapie

De biologische achtergrond van de humane somatische - en kiembaangentherapie

1.1  Wat gentherapie is. Soorten van humane gentherapie

Genthera­pie kan worden omschreven als de voorkóming of behan­deling van ziektes bij de mens d.m.v. de introductie van recombinant-DNA in weefsels of organen[1]Süssenbach heeft reeds in het derde rapport van het Linde­boom Instituut[2] aangegeven, welke vier varianten van de gen­the­rapie hij onderschei­dt. Deze vier varianten noemde hij:

1) de somati­sche genthe­rapie; 2) de kiem­baan­gen­thera­pie; 3) de verbete­ringsgenthera­pie, en 4) de eugene­ti­sche gen­thera­pie.

Liever zouden wij hier echter, met de vooraanstaan­de Ameri­kaanse genthera­peuticus dr. W. French Anderson, de term thera­pie willen reserveren voor de eerste twee genoemde vari­anten, en de term mani­pu­latie willen gebrui­ken voor de twee laatste vormen[3]. Immers, het gaat bij deze twee laatste vormen in principe niet over therapeutisch ingrijpen. Een preventieve ingreep in een op dat moment nog gezond individu zouden wij niet een vorm van "verbetering", maar een vorm van therapie willen noemen.

Zo spreken wij dan over:

1) de somatische gentherapie, waarbij DNA wordt geïntroduceerd in lichaamscellen (somatische cellen);

2) de kiembaangentherapie, waarbij als doelwitcellen ("target­cellen") voor het in te brengen DNA hetzij geslachtscellen (gameten) of hun voorlopers, hetzij de nog omnipotente cellen van zeer vroege (t/m ongeveer het achtcellige stadium) zgn. pre-implantatie-embryo's (p.i.e.'s) fungeren. In het eerste geval spreken wij over gametocyt-therapie, in het tweede geval over embryo-therapie. Genetische veranderingen worden overge­dragen op het nageslacht;

3) de verbeteringsgenmanipulatie, die geen therapeutische ingreep is, maar waarbij er in een op zich (nog) gezond indi­vidu voor een eenvoudige, door één gen bepaalde (zgn. monoge­ne) eigenschap een extra gen wordt ingebracht;

4) de eugenetische genmanipulatie, die evenmin therapeutisch van aard is, maar waarbij er getracht wordt door inbreng van DNA complexe eigenschappen, die (mede) door verschillende genen bepaald worden, zoals intelligentie, temperament en muzikale aanleg, te beïnvloeden.

Er kan in geval van 3) en 4) nog nader onderscheiden worden tussen op somatische cellen respectievelijk op de kiembaan gerichte verbeteringsgenmanipulatie en eugenetische genmanipu­latie.

Een andersoortige indeling is eveneens mogelijk. Dan wordt er gekeken naar wat er op DNA-niveau gentechnisch gebeurt. Dan kunnen onderscheiden worden:

1) de gensubstitutie (genvervanging);

2) de genvernietiging.

3) de genadditie (gen­com­plemen­ta­tie)

ad 1) De meest zuivere en adequate vorm van gentherapie is de correctie van een defect gen d.m.v. homologe recombinatie, zodat het resultaat is de normale, zgn. wild-typische variant (genvarianten heten ook wel allelen). DNA heeft nl. de eigen­schap, dat het, wan­neer het wordt ingebracht in cel­len, kan hybri­diseren met ermee homologe sequenties op het chromosoom, teneinde ermee te recombineren. Deze tech­niek bevindt zich echter nu nog slechts in het experi­mentele stadium.

Door middel van gensubstitutie kunnen monoge­ne, homozygoot reces­sieve erfe­lijke aan­doe­ningen, alsme­de dominante en ge­slachts­gebonden erfelijke ziektes adequaat worden bestreden. Ook kan er herstel plaatsvinden van functies, die verlo­ren zijn gegaan ten gevolge van door chro­mosomale transloca­ties en deleties geïnactiveerde genen. Dit gebeurt dan door inbouw van de voor die betreffende func­ties verantwoordelijke genen op heterologe loci. Ook kunnen door aneuploïdie veroorzaakte erfelijke ziek­tes bestre­den worden. Tenslotte kunnen complexe, niet-erfelij­ke of slechts ten dele erfelijke ziektes, zoals kanker, hart­ziektes, a.i.d.s. en vaatziektes gentherapeutisch benaderd worden[4].

Een groot pluspunt van bovengenoemde techniek van de gen­ver­vanging is, dat er een precieze in situ correctie van de locus plaatsvindt, zonder dat een verstoring van de struc­turele en regulatori­sche eenheden van het gen optreedt. Ook genen die in hun expressie op een zeer complexe wijze en/ of door sequenties die op heel andere plaatsen in het genoom liggen gere­gu­leerd worden kunnen met deze methode gecorri­geerd worden. Zij wordt híerom als zeer adequaat beschouwd, omdat de zeer geringe wijziging die wordt aangebracht op de te repare­ren locus de vaak zeer complexe wijze van regulatie in ruimte en tijd van de activiteit van het gen ongemoeid laat[5]. Er is dus geen grens aan de grootte van een gen[6]. En zo vindt er ook een fysiologisch normale genexpressie plaats[7], wat bij de techniek van de genad­ditie d.m.v. retrovirussen niet het geval is (zie hierna). En er treden in het gecorrigeerde gen even weinig mutaties ten gevolge van "hot spot"-recombinaties op als in het "wild-type" gen[8].

Zoals gezegd kunnen d.m.v. gen­correctie via homologe recom­binatie in principe ook dominante en geslachtsgebonden erfe­lijke ziekten adequaat worden bestre­den.

Bestrijding van dominante erfelijke aandoeningen, waarbij aan de ziekte een door dat dominante gen gecodeerd giftig eiwit ten grondslag ligt, heeft echter te maken met het ver­schijnsel van de allel-competitie. Dit is het verschijnsel, dat er homologe recombinatie van het correcte targe­ting-DNA met het ermee identieke wildtypische, "gedomineerde" allel plaats­vindt, is iets groter dan de kans, dat dat met het gemuteerde, dominante allel gebeurt, zodat er niets verbetert, en de efficiëntie nog lager is dan gewenst[9]. Voorts kan gen­cor­rectie altijd ook nog te kampen hebben met een verlaagde effi­ciëntie t.g.v. homologe recombinatie met inactieve, niet-functionele, zgn. "pseudo-genen"[10].

Op zich normale, maar ongewenste allelen kunnen door ge­wenste worden gesubstitueerd, maar hier zouden wij liever niet van een gentherapie willen spreken, maar eerder van een cosme­tische, of - wanneer zij wordt toegepast op grotere, een hele bevolking omvattende schaal in het kader van een "rassen­hygië­nisch" program - eugenetische ingreep (dit laatste betreft dan alleen ingrepen in de kiembaan).

De zgn. verbeterings-gentherapie neemt een tussenpositie in. Het is immers de vraag, wanneer afwijkingen van het sta­tistische gemid­delde als abnormaliteiten moeten worden be­schouwd. Hoe groot is in dezen m.a.w. de standaard-deviatie ?

ad 2) De grondige vernietiging van het dominante allel (in geval van dominante erfelijke aandoeningen) of van het zich als dominant manifesterende, recessieve allel (in geval van geslachtsgebonden erfelijke ziekten) is ook een aantrekkelijke oplossing, hoewel ook dit nu nog alleen een academische moge­lijkheid is[11]. Ook erfelijke ziekten, die door een overschot aan genen veroorzaakt worden, zoals Downs- en Klinefelters syndro­men, komen voor deze variant van gentherapie in aanmer­king[12]. Genvernietiging zou bv. kunnen plaatsvinden d.m.v. insertie-mutagenese.

ad 3) Bij de huidige stand van de technologie is klinisch echter alleen nog slechts een andere vorm van gentherapie mogelijk, nl. de toevoeging van een nor­maal allel van een bepaald gen, zonder dat er homologe recombinatie plaats­vindt (genadditie, gencomplementatie)[13]. Er is dan wel een continue toevoeging van in vitro gecor­rigeerde tar­getcellen aan de patiënt vereist. Want de stabiliteit van het extra inge­brachte erfelijke materiaal is maar gering. Dit is het gevolg van het feit, dat het recombi­nant-DNA (het zgn. "tran­sgen", ingebouwd in een vector, zoals een retrovirus of een plasmide) meestal ­niet d.m.v. homologe recombina­tie in het gast­heerge­noom inge­bouwd wordt. Het vreem­de DNA blijft dan extrachromosomaal (episo­maal) en wordt niet mee-gerepliceerd. Na verloop van tijd is er dan geen spoor meer van het inge­brachte trans­gen of van het ge­wenste, correc­te genpro­duct aanwezig. Doordat met gencomple­mentatie-therapie alleen maar een ontbrekend genpro­duct is toe te voegen, komen enkel recessieve ziekten ervoor in aanmer­king. Het betreft hier dus, i.t.t. de gen­cor­rectie,  "a mere physi­o­logi­cal cure at the cellular level".

Om dit met de genadditie-strategie verbonden nadeel van het verdwij­nen van het transgen(product) in volgende celgeneraties te ondervangen tracht men transgenen in zeer lang levende, ongedif­feren­tieerde stamcel­len te bren­gen, uit welke laatste alle typen bloedcel­len ontstaan[14].

Ten gevolge van het voornoemde en van andere problemen (zie par. 1.4) kan gesteld worden, dat "Current gene therapy tech­no­logy is primarily limi­ted by the neces­sity for ex vivo manipu­la­tions of target tissu­es"[15]. Maar niet alle celtypen lenen zich hier­voor[16]. Wel wordt er snelle vooruitgang in het veld geboekt op het vlak van "cell-targeting" en efficiën­tie van genover­dracht door gebruik te maken van nieuwe virale vecto­ren, zoals bv. vectoren die van het her­pesvirus of van adeno­virus zijn afgeleid (zie par. 2.2).

 1.2 Genoverdrachtmethodes

De somatische gentherapie levert momenteel (gen)technisch gezien minder problemen op dan de kiembaangentherapie. Ze is goed te vergelijken met orgaan­transplantaties, en wordt momen­teel geschikt geacht voor toepassing bij mensen. Ze behelst "(...) het inbrengen van een correct gen in de somatische of lichaamscel­len van een individu met het doel om de klinische gevolgen van een erfelijke ziekte te elimine­ren"[17]Dit inbrengen kan m.b.v. non-virale methodes of door ge­bruik te maken van virale vectoren.

 1.2.1 Non-virale genoverdracht-methodes

 Non-virale genoverdracht-methodes omvat­ten o.a.:

 1) het met calcium fosfaat[18] op targetcellen co-precipiteren van het DNA met het correcte gen;

2) de directe in vivo micro-injectie van naakt DNA (DNA als medicijn gebruikt, ook wel gentherapeutica genoemd)[19];

3) koppeling (conjugatie) van DNA aan eiwitten (zgn. liganden) die specifieke receptoren op targetcellen herkennen waarna endocytose kan plaatsvinden[20];

4) bombardering van targetcellen met gouden- of wolfraam- microbolletjes die DNA hebben geabsorbeerd[21];

5) DNA-overdracht door recombinant-plasmiden te omhullen met liposomen die vervolgens fuseren met de targetcelmembranen (lipofectie)[22].

 In deze gevallen worden van het gewenste gen door klonering in een bacteriële plasmide of in een van gist afgeleide cosmi­de voldoende grote hoeveelheden geproduceerd. Zulke non-virale  genoverdracht-methodes hebben in vergelij­king met het gebruik van virussen als vectoren diverse voorde­len:

 1) er vindt geen overdracht plaats van ongewenst viraal gene­tisch materiaal naar de cel[23], waardoor men niet behoeft te vrezen voor:

a) een virusinfectie;

b) de activering van een proto-oncogen tot een oncogen door insertie-mutagenese;

c) de activering van latente endogene virussen in het gast­heergenoom;

2) recombinant-plasmiden zijn eenvoudiger en sneller te maken dan retrovirale vectoren.

 Non-virale genoverdracht-methodes hebben o.a. echter tegen, dat de genex­pressie maar van korte duur is, waardoor toedie­ning veel langere tijd moet worden volge­hou­den.

 1.2.2 Virale genoverdracht-methodes

 Als virale vectoren worden RNA-virussen (de zgn. retrovi­russen) of DNA-virussen (adenovirussen en de kleine, met adenovirussen geassocieerde virussen (AAV's)) benut. Voordelen van de gentransfer m.b.v. retrovirussen[24] in het kader van een genadditie-strategie zijn: 

 1) er vindt een directe integratie plaats van het retrovirale genetische materiaal in de chromosomen van de gastheercel[25];

2) een hoge efficiëntie van de virusinfectie[26];

3) in het genoom van de gastheercellen wordt doorgaans maar 1 exemplaar van het gekloneerde gen ingebouwd[27];

4) veel retrovirussen zijn zeer gastheercelspecifiek[28];

5) vele cellen tegelijk kunnen getransfecteerd worden[29].

Als nadelen gelden:

1) de patiënt kan tegen het ge­bruik van een retrovirus als vector een immuniteit ontwikke­len;

2) ten gevolge van de stabie­le integra­tie in het gastheer­genoom van retrovirale vectoren kunnen eventuele schadelijke nevenef­fecten minder makkelijk worden terugge­draaid dan bij gebruik van non-virale vectoren en van gentherapeutica;

3) het retro­virale genoom kan genen van een maar beperkte omvang bevatten[30]. Dit bete­kent dat genen, die op complexe wijze in hun expressie geregu­leerd worden niet in aanmerking komen om in retrovirale vectoren ingepakt te wor­den, omdat hun regulerende sequenties er niet in passen;

4) alleen zich replice­rende cellen kunnen ge­trans­fec­teerd wor­den[31];

5) de inte­gratie van het provirus in het DNA van de gast­heer­cel is niet altijd even nauwkeurig, maar "at random", waardoor er onge­wenste spontane zgn. "hot-spot" recombina­tie kan optre­den[32] met als moge­lijke gevolgen:

a) de inactivering van andere genen[33];

b) tumor­groei in geval van inbouw in het gastheergenoom in de buurt van een proto-onco­gen (insertie-mutagenese)[34];

c) er kan in de gastheer een virusin­fectie ont­staan door active­ring van latente endogene provirussen[35];

6) de precieze locatie van het defect in het te repareren gen in het genoom moet bekend zijn (behalve bij de genadditie);

Hoewel er intussen methoden zijn ontwikkeld om elk van deze nadelen te onder­vangen[36], kent de in par. 1.1 genoemde tech­niek der genvervanging d.m.v. een nauwkeurige in situ homolo­ge recombi­natie geen van de nadelen c.q. gevaren die met het gebruik van retrovirussen verbonden zijn. 

Ook recombinant-adenovirussen zijn een alternatief voor het gebruik van retrovirussen[37]. Adenovirussen zijn grote, dubbel­strengs DNA-virussen die cellen binnendringen via receptoren. Hun genoom migreert naar het kernplasma maar blijft extrachro­mosomaal (episomaal), waardoor het niet meerepliceert en dus na enkele celgeneraties totaal verdwijnt. Als voordelen gel­den, dat zij voor mensen niet car­cinogeen zijn, in algemene zin nauwe­lijks pathogeen zijn, een vrij grote verpakkingscapa­citeit bezitten, tot zeer hoge titers gekweekt kunnen worden en - voor­al - niet replice­rende cellen kunnen transfecte­ren. Hoewel zij een breed gastheercelbereik hebben, zijn met name long­cellen, die niet in vitro te culti­veren zijn, hun doel­wit. Het is al m.b.v. adeno­vi­rus-vectoren gelukt om het cor­recte gen voor het bij muco­vis­coïdo­sis/ pancreas-fi­brose/ taai-slijmziekte (Eng.: "cystic fibrosis") defecte eiwit in ademha­lings­epi­theelweefsel te brengen[38]. Het nadeel van hun lage pathoge­nici­teit is, dat hun genoom transcriptioneel inert is, waardoor de mate van expressie van het transgen afhangt van de ermee overgedragen non-virale promotors[39].

AAV's kunnen alleen kleine hoeveelheden (< 5 kb) vreemd DNA bevatten, maar integreren nauwkeurig op een bepaalde plaats in chromosoom no. 19. Alleen is dat nog niet voorgekomen bij gebruik van AAV's als vector[40].

Tenslotte wordt er ook geëxperimenteerd met een combinatie van virale en non-virale genoverdrachtmethodes. Recombinant-plasmiden en -cosmiden worden hierbij gekoppeld aan antilicha­men die het adenovirus herkennen. Met de zo gevormde triparti­te complexen kunnen cellen worden getransfecteerd[41]. Met be­hulp van dergelijke gemengd biologische en fysische genover­drachtprocedures tracht men de voordelen van de beide systemen te combineren in een nieuw systeem.

1.3. Welke ziekten mogelijk behandeld kunnen worden

Door het gebruik van retrovirussen als vectoren voor de overbrenging van (gekloneerde) normale genen naar somatische targetcellen kunnen de genetische defecten die ten grondslag liggen aan vele recessieve erfelijke aandoenin­gen in principe adequaat bestreden worden[42]. Als somatische targetcellen kun­nen bv. de omnipotente (ofwel totipotente) hematopoïetische stam­cellen van het been­merg, lymfocyten (witte bloed­lichaam­pjes), endotheelcel­len, fibroblasten, neuro­nen, spier­cellen en lever­cellen worden gebruikt[43]. De celkeuze is afhankelijk van de te bestrijden ziek­te. Ziekten die in aanmerking komen zijn o.a. sikkelcela­nemie (bloedar­moe­de), ADA-deficiën­tie[44], hemo­fi­lie (bloeder­ziek­te), spierdys­trop­hie (de Ziekte van Duchen­ne)[45] en de reeds genoemde muco­vis­coïdo­sis[46].

De eerste humane somatische gentherapie dateert van 1990 en behelsde de transfer van een correct allel van het ADA-gen naar lymfocyten van een patiënt met een defecte genvariant[47]. Door dit defect kan er geen enzymati­sche afbraak van een be­paalde stof plaats vinden waardoor het immuunsysteem niet functioneert. De hierdoor aan S.C.I.D. lijdende pa­tiënt is dan zeer vatbaar voor allerlei infec­tie­ziek­ten, wat in principe al spoedig de dood ten gevolge heeft.

De trans­fer (Ned.: over­dracht) van het correcte ADA-gen vindt plaats door de pa­tiënt een infuus te geven van zijn eigen cellen, die zijn geïn­fecteerd met een retrovirale vector waarin ex­pressie plaatsvindt van het humane ADA-gen, te leg­gen. De resultaten waren zeer bemoe­digend. De meeste gema­nipuleerde cellen wisten zich langer dan zes maanden na beeïn­diging van de infusie te hand­haven.

Ook wordt er gepoogd om d.m.v. somatische gentherapie kanker te bestrijden. Hiertoe isoleert men de zgn. tumor-infiltrerende lymfocyten (TIL-cellen) uit tumoren, transfec­teert deze vervolgens met een recombinant-retrovirus waarin het gen voor interferon of voor TNF (tumor necrose factor) is ingebouwd, en brengt vervolgens deze genetisch gemodificeerde lymfocyten terug in de tumoren[48]. Door de pro­ductie van inter­feron of TNF door deze TIL-cellen treedt er tumor-regressie op.

Het is waarschijnlijk, dat er in de toekomst belangrijke nieuwe somatische gentherapeutische technieken zullen worden ontwikkeld, waarmee bv. ook genoverdracht naar zich niet delende cellen kan plaatsvinden.

 1.4. Problemen

Hoewel grote vorderingen worden gemaakt op het gebied van de gentherapie bestaat er nog een groot aantal te overwin­nen moeilijkheden. Voordat de humane gentherapie op grote schaal klinisch toepasselijk wordt, moeten in hoofdzaak nog drie technische hordes genomen worden[49]:

 1) de ontwikkeling van vectoren die direct in de patiënt kunnen worden geïnjecteerd en die specifiek het ge­wenste weefsel of orgaan binnendringen, alwaar zij het trans­gen in situ afleveren[50]. De efficiëntie van de genoverdracht van de meeste momen­teel in omloop zijnde vecto­ren is nog erg laag[51]. Gemiddeld slechts ongeveer 10 % van de targetcellen ontvangt het trans­gen. En van vele transgenen wordt hun ex­pressie te snel uitgeschakeld, zodat het therapeutische effect te laag is[52]. Ook dienen er genoverdrachtsystemen te komen die op cellen, die zich in de rustfase bevinden en zich dus niet delen, kunnen worden toegepast[53];

2) de vector dient op een ongevaarlijke plaats op het chromo­soom te integreren of homoloog te recombineren met het te vervangen defecte gen. Zulks ter voorkoming van tumorgroei. Maar het is nog niet gelukt om homologe recombinatie-percenta­ges te verkrijgen die hoog genoeg zijn voor toepassing in de klinische practijk;

3) het ingebouwde correcte gen dient te kunnen reageren op allerlei fysiologische veranderingen in het bloed en in de niveaux van de verschillende metabolieten. Zo dient een insu­line-transgen qua activiteit te responderen op de bloedsuiker­spiegel. Er moet dus meer kennis worden verworven van de factoren die de genexpressie van het transgen in somatische cellen sturen[54]. Ook moeten er methoden worden ontwikkeld om immuun­re­acties tegen de lichaamsvreemde eiwitproducten na inbreng van de genetisch gemanipuleerde cellen te voorkomen[55].

Een belangrijk probleem betreft voorts de kweek en de manipulatie van cellen zonder dat de geschiktheid om terug­geplaatst te kunnen worden verloren gaat[56]. Een beter begrip van de somatische celtransplantatie is daartoe noodzakelijk. Revoluti­onair zou zijn de in vitro ontwikkeling van klonen van de omnipo­tente humane haematopoïetische stamcellen die - anders dan nu het geval is - na terugplaatsing kunnen voortbe­staan. Zulke culturen zouden dan genetisch door homologe recom­bina­tie gemodificeerd en vervolgens vermenigvuldigd kunnen wor­den[57].     

Een systeem om in vivo gencorrectie toe te pas­sen heeft nog te maken met ver­schillen­de problemen. Het verkrij­gen van een effi­ciënte en precieze integratie van het cor­recte targe­ting-DNA in de cel­kernen van de juiste celty­pen, waarin het te corri­geren gen functioneel behoort te zijn, is het groot­ste.  Wil somati­sche gentherapie dus moge­lijk zijn, dan dient de ziekte de aantasting te betreffen van een weefsel of orgaan  dat een­voudig in vitro te manipule­ren is, en waarbij de gema­nipu­leer­de cellen nog lange tijd overleven na te zijn terugge­trans­planteerd naar de pa­tiënt[58]. Gelukkig zijn voor de gene­zing van sommi­ge ziek­tes niet al te hoge percentages genex­pressie vereist. Zo is voor de bestrijding van S.C.I.D., waaraan de ADA-deficiën­tie ten grondslag ligt, maar 5-10 % van de norma­le genexpres­sie noodzakelijk[59].

De zeer lang levende onge­differentieerde stamcellen in het beenmerg, waaruit zich de diverse bloedcellen ontwikkelen, worden als ideale targetcellen beschouwd. Dan hoeft men name­lijk niet steeds de genthe­rapeu­tische behandeling te herhalen vanwege het uitgestorven zijn van alle gemani­puleerde cel­len[60].

1.5. Nader over de kiembaangentherapie[61]

De kiembaangentherapie wordt al toegepast op dieren, resul­terend in transgene exemplaren. Dit zijn dieren, waarin het erfelijk materiaal - idealiter - in iedere somatische- en geslachtscel door genmanipulatie gecorrigeerd is. Deze correc­tie kan, zoals gezegd, geschieden door genadditie, gendeletie (-vernietiging) en genvervanging. Drie procedures zijn in dezen mogelijk:

1) Men kan een DNA-construct injecteren in de nog niet ver­smolten mannelijke en vrouwelijke pronucleï van eencellige zygotes of in de kernen van tweecellige embryo's. Idealiter wordt dan 1 copie van de correcte genvariant ingebouwd in een chromosoom (al is insertie van verscheidene exemplaren (de zgn. concatemeren) niet problematisch). Het is het beste wanneer integratie plaatsvindt in het eencellige stadium. In geval van iets latere inbouw is de kans groter, dat niet alle cellen van de latere stadia van de ontoge­nese transgeen zijn, hetgeen resulteert in zgn. chime­ren.

2) Men kan gebruik maken van recombinant-retrovirussen. Deze worden onder de het p.i.e. beschermende zgn. zona pellu­cida of in de blastocysten geïnjecteerd, of zij worden teza­men met p.i.e.'s zonder zulk een zona pellucida geïncubeerd. Deze techniek is veel eenvoudiger dan de sub 1) vermelde, en ook worden er geen concatemeren ingebouwd, maar steeds 1 gencopie per integratiepunt. Zowel bij deze techniek als bij techniek 1) kan overal in het genoom integratie plaatsvinden, en er kan - vooral met techniek 2) - meer dan één integratie­punt zijn. Dit laatste heeft als gevolg, dat de genexpressie, afhanke­lijk van het integratiepunt, enorm kan variëren in tijdstip en hoeveelheid. Ook is de destructie van een ander gen mogelijk.

3) Transgene dieren kunnen ook ontwikkeld worden door uit de blastocyst embryonale stamcellen te halen. Deze cellen delen zich ongeremd zonder te differentiëren, waardoor zij te allen tijde in de blastocyst ter herintegratie teruggeplaatst kunnen worden. Zodoende kunnen de transgene embryonale stam­cellen zich gaan ontwikkelen tot enig deel van de foetus, inclusief gameten, resulterend in een chimere foetus. Aange­zien zoogdie­ren diploïd zijn, zal er in de practijk in de embryonale stamcellen insertie op een bepaald punt in slechts één van de twee homologe chromosomen geschieden (hemizygotie). De nakome­ling­schap van de chimeer zal dan voor een deel in alle (nl. wanneer er gameten uit ontstaan), voor een deel in geen van haar cellen transgene­tisch zijn.

Het grote voordeel van embryonale stamcellen is, dat zij eenvoudig en massaal in vitro transgenetisch gemanipuleerd kunnen worden m.b.v. DNA-injectie of RNA-virussen. Ook zijn de met succes transgenetisch gemaakte cellen goed te selecteren. Een nadeel van zulke manipulaties is, dat de uitkomst onzeker is.

R.A. Fleischman acht het vanuit technisch en ethisch stand­punt bezien onwaarschijnlijk, dat er kiembaangentherapie voor recessieve ziektes op humane p.i.e.'s uitgevoerd zal worden. Dit omdat er, wil kiembaangentherapie uitgevoerd worden, eerst pre-implantatie diagnose (p.i.d.) van p.i.e.'s nodig is. Maar in dat geval "it would be far simpler both technically and ethically to implant only the normal or heterozygous embryos in the mother rather than to attempt to carry out gene trans­fer on the recessive mutant embryos"[62] (!). Daar komt bij, dat de effi­ciën­tie van de overdracht van een vreemd gen in de zygote van een zoogdier d.m.v. micro-injectie zeer laag is, en dat noch de integratie in het genoom, noch de correcte expres­sie van het gen in p.i.e.'s is te "screenen".

Litteratuur:

 

- Acsadi, G., Dickson, G., Love, D.R., Jani, A., Walsh, F.S., Gurusinghe, A., Wolff, J.A., Davies, K.E.; Nature 352 (1991): 815-818

- Akhtar, S. en Ivinson, A.J.; Nature Genetics 4 (1993): 215-217

- Bout, A., Perricaudet, M., Baskin, G., Imler, J.-L., Scholte, B.J., Pavirani, A., Valerio, D.; Human Gene Therapy 5 (1994): 3-10

- Coghlan, A.; New Sciencist (22-5-1993): 16

- Collins, F.S.; Science 256 (1992): 774-779

- Correll, P.H., Colilla, S., Dave, H.P.G., Karlsson, S.; Blood 80(2) (1992): 331-336

- Culver, K.W., Ram, Z., Wallbridge, S., Ishii, H., Oldfield, E.H., Blaese, R.M.; Science 256 (1992): 1550-1552

- Dusty Miller, A.; Nature 357 (1992): 455-460

- Felgner, P.L. en Rhodes, G.; Nature 349 (1991): 351-352

- Fleischmann, R.A.; The American Journal of the Medical Sciences 301(5) (1991): 353-363

- French Anderson, W.; Human Gene Therapy 5 (1994): pp. 1-2

- French Anderson, W.; Human Gene Therapy 5 (1994): pp. 149-50

- Green, E.D. en Waterston, R.H.; J.A.M.A. 266(14) (1991): 1966-1975

- Gussoni, E., Pavlath, G.K., Lanctot, A.M., Sharma, K.R., Miller, R.G., Steinman, L., Blau, H.M.; Nature 356 (1992): 435-438

- Hyde, S.C.; Nature 362 (1993): 250-255

- Jakobovits, A., Moore, A.L., Green, L.L., Vergara, G.J., Maynard-Currie, C.E., Austin, H.A., Klapholz, S.; Nature 362 (1993): 255-258

- Lynch, C.M., Clowes, M.M., Osborne, W.R.A., Clowes, A.W., Dusty Miller, A.; P.N.A.S. 89 (1992): 1138-1142

- Morgan, R.A. en Anderson, W.F.; Annu. Rev. Biochem. 62 (1993): 191-217

- Ragot, T.; Nature 361 (1993): 647-650

- Ram, Z., Culver, K.W., Walbridge, S., Blaese, R.M., Oldfield, E.H.; Cancer Research 53 (1993): 83-88

- Sanders Williams, R.; The American Journal of the Medical Sciences 306 (1993): 129-136

- Schedl, A., Montoliu, L., Kelsey, G., Schütz, G.; Nature 362 (1993): 258-261

- Seidel jr., G.E.; Embryo Transfer 7(1) (1992)

- Thompson, L.; Science 258 (1992): 744-746

- Vega, M.A.; Human Genetics 87 1991): 245-253

- Wolff, J.A., Malone, R.W., Williams, Ph., Chong, W., Acsadi, G., Jani, A., Felgner, Ph. L.; Science 24 (1990): 1465-1468

 

 

 

 

 

 



    [1] Sander Williams, p. 129

    [2] "Ethische en maatschappelijke aspekten van de moderne gentechnologie"; Ede (1988): pp. 18/9 (afko: EG)

    [3] W. French Anderson: "Uses and Abuses of Human Gene Transfer"; Human Gene Therapy 3 (1992): p. 1; cf. ook de omschrijving van gentherapie, die hij samen met Richard A. Morgan gaf in "Human Gene Therapy"; Annu. Rev. Biochem. 62 (1993): p. 192: "Gene therapy can be defined simply as the transfer of new genetic material to the cells of an individual with resulting therapeutic benefit to the individual".

    [4] Morgan & Anderson, pp. 192/7; Dusty Miller, p. 460; Fleischmann, p. 360

    [5] Vega, pp. 245, 247

    [6] a.a., pp. 247/8

    [7] a.a., p. 247

    [8] a.a., p. 247

    [9] a.a., p. 250

    [10] a.a., p. 250

    [11] a.a., p. 245

    [12] a.a., p. 250

    [13] a.a., pp. 245, 247, 251

    [14] Dusty Miller, pp. 458/9

    [15] Morgan & Anderson, p. 192

    [16] a.a., p. 193

    [17] EG, p. 18; Zoals het uit deze omschrijving moge blijken is er slechts sprake van bestrijding van de klinische gevolgen van zo'n ziekte. Pas d.m.v. de kiembaangentherapie is in principe radicale uitroeiing van de immers erfelijke ziekte mogelijk (in principe, want er bestaat de theoretische mogelijkheid tot terugmutaties).

    [18] Morgan & Anderson, p. 197; Fleischmann, p. 355

    [19] Morgan & Anderson, p. 197; Sander Williams, p. 132; Wolff et al; Felgner & Rhodes; Fleischmann, p. 355

    [20] Mogan & Anderson, pp. 197, 198; Dusty Miller, p. 458

    [21] Sander Williams, p. 132

    [22] Morgan & Anderson, p. 197, pp. 198/9; Sander Williams, p. 132; Dusty Miller, p. 457

    [23] Morgan & Anderson, p. 198

    [24] Men spreekt in dit geval van "transductie" i.p.v. van "infectie" omdat de retrovirussen zodanig zijn "verminkt", dat ze zich niet in het targetweefsel kunnen vermenigvuldigen en een virusinfectie kunnen veroorzaken (Sander Williams, p. 131; Dusty Miller, p. 457)

    [25] Morgan & Anderson, p. 199

    [26] Sander Williams, p. 131; Dusty Miller, p. 457; Fleischmann, p. 355; Vega, p. 247

    [27] Fleischmann, p. 355

    [28] Sander Williams, p. 131; Dusty Miller, p. 457

    [29] Fleischmann, p. 355

    [30] Sander Williams, p. 131; Fleischmann, p. 355; Vega, p. 247

    [31] Sander Williams, p. 131; Dusty Miller, p. 457; Fleischmann, pp. 355, 357

    [32] Vega, p. 247

    [33] a.a., p. 248

    [34] Sander Williams, p. 131; Dusty Miller, p. 457; Fleischmann, p. 355; Vega, p. 248

    [35] Sander Williams, p. 131; Vega, p. 248

    [36] Fleischmann, p. 355

    [37] Sander Williams, p. 131; Morgan & Anderson, p. 202; Dusty Miller, p. 458; Bout et al, pp. 3/10

    [38] zie o.a. Bout et al, p. 3

    [39] Sander Williams, p. 131

    [40] Morgan & Anderson, pp. 199, 212

    [41] a.a., p. 198

    [42] Zie voor een overzicht Morgan & Anderson, p. 193; Dusty Miller, p. 460

    [43] Zie voor een overzicht van de diverse targetceltypen bv. Fleischmann, pp. 358/60.

    [44] Lynch et al

    [45] Akhtar & Ivinson, p. 215; Ascadi et al; Gussoni et al; Ragot et al

    [46] Collins; Hyde et al

    [47] Thompson, p. 744; Dusty Miller, p. 455, pp. 456/7; Morgan & Anderson, pp. 206/8

    [48] Akhtar & Ivinson, pp. 215/6; Coghlan; Ram et al; Culver et al; Thompson, p. 746; Dusty Miller, p. 460; Morgan & Anderson, pp. 203/4, pp. 208/9

    [49] Morgan & Anderson, p. 212

    [50] zie ook Dusty Miller, p. 460

    [51] Vega, p. 246

    [52] Thompson, p. 744; Vega, p. 247

    [53] Dusty Miller, p. 460

    [54] cf. Dusty Miller, p. 460: "(...) I have observed a dramatic decrease in expression (. 1,500-fold) of a retroviral vector in skin fibroblasts after transplantation, but not in culture, whereas the same vector promotes long-term protein production in smooth muscle cells in the same animal model". 

    [55] Dusty Miller, p. 460

    [56] Morgan & Anderson, p. 212

    [57] Dusty Miller, p. 460

    [58] Omdat longcellen zeer moeilijk in vitro te manipuleren zijn, is i.g.v. longziektes (zoals mucoviscoïdosis) een in vivo benadering vereist. Deze wordt gevolgd m.b.v. adenovirussen.

    [59] Fleischmann, pp. 354/5

    [60] Thompson, p. 746

    [61] Zie nader hierover Seidel

    [62] Fleischman, p. 353